酯酶是一种催化酯键水解和合成的酶的总称,具有α/β折叠结构,是一类丝氨酸水解酶.微生物酯酶具有来源广、种类多、反应条件温和、稳定性好、底物专一、催化活性高等特点,是工业用酯酶的主要来源.本文从不同环境中筛选产酯酶微生物并进行基因克隆、表达和酶学性质研究,具体研究结果如下:
　　　　采用三丁酸甘油酯琼脂平板法对来自盐碱湖、红树林、湿地公园等不同环境样品中的产酯酶微生物进行筛选.通过菌株形态观察及分子生物学鉴定,共鉴定了60株产酶菌株,主要为芽孢杆菌属、假单胞菌属与不动杆菌属.
　　　　对筛选得到的酶学性质较好的产酯酶菌株进行酯酶基因的克隆，共获得18个酯酶基因片段，与己知的酯酶的蛋白序列一致性在67％至100%之间。基于获得的片段序列，采用同源克隆技术与TAIL-PCR方法克隆得到2个酯酶基因全长。来源于盐湖嗜盐嗜碱菌SL3与来源于舟山群岛巨大芽胞杆菌ZB7-11的酯酶基因全长分别为636bp与774bp，各编码211与257个氨基酸。Blastp分析表明这两个酯酶与Alkalibacterium　sp.　AK22和Bacillus　megaterium来源的酯酶蛋白一致性最高分别为69%与98%。
　　　　将estSL3、estZB7-11两个基因分别在大肠杆菌中进行异源表达，并对重组酯酶rEstSL3与rEstZB7-11进行纯化和酶学性质研究。rEstSL3与rEstZB7-11最适作用底物分别为对硝基苯乙酸酯(pNPC2)和对硝基苯丁酸醋(pNPC4)，比活分别为256.86U/m和104.57U/mg;最适作用pH分别为9.0与8.0，在pH　6.0-10.0均具有良好的稳定性;最适作用温度均为30℃，且rEstSL3与rEstZB7-11分别在0℃与20℃可保持68%与80%左右的酶活，在低于60℃时均具有良好的热稳定性。在最适条件下，rEstSL3与rEstZB7-11对底物pNPC2与pNPC4的Vmax分别为769.23μmol/(mg`min)与96.15μmol/(mg`min),Km分别为0.15　mmol/mL与0.10mmol/mL;同时两者对Mn2+、CO2+、Ni2+等金属离子，Tween　80、EDTA及甲醇、乙醇等溶剂均具有一定抗性。而且rEstSL3对高浓度NaCl具有良好的耐受性，为耐盐耐碱性的低温碱性酯酶。