Herein,　a　novel　dual-function　paper-based　biosensor　using　diffusion　wet　area　as　readout　has　been　developed　for　simple　and　sensitive　detection　of　hyaluronidase　(HAase)　and　human　papillomavirus　(HPV)　16　DNA,　respectively.　The　target-regulated-water　absorption　hydrogel　synthesized　by　hyaluronic　acid　(HA)　and　single-stranded　DNA　(ssDNA)　is　chosen　as　an　ideal　material　for　diffusion　wet　area　generation　on　paper.　The　hydrogel　can　be　degraded　through　the　enzymolysis　of　HA　by　HAase　or　the　trans-cleavage　of　ssDNA　by　HPV　DNA-activated　CRISPR/cas12a　system.　Then　the　diffusion　wet　area　generated　by　the　broken　hydrogel　with　the　free　water　released　from　the　hydrogel　dropped　on　the　glass　fiber　filter　paper　can　be　captured　by　a　smart-phone　and　calculated　by　the　product　of　the　pixel　ratio　(pixels　of　wet　area/pixels　of　glass　fiber　filter　paper)　and　actual　area　of　the　filter　paper.　The　diffusion　wet　area　has　good　linear　relationships　with　HAase　(0–40　U/mL)　and　HPV　16　DNA　(0.1–1000　pM),　respectively.　The　biosensor　provides　a　novel　signal　readout　mode,　shows　satisfactory　sensitivity　with　the　detection　limits　of　0.15　U/mL　for　HAase　and　66.95　fM　for　HPV　16　DNA,　and　has　been　successfully　used　for　HPV　16　DNA　and　HAase　detection　in　clinical　urine　and　cervical　brush　samples,　which　is　promising　for　early　cervical　cancer　screening　and　HPV　monitoring　in　HPV　patients.　©　2024　Elsevier　B.V.