目的:本研究旨在评估IL-12联合肿瘤新抗原m　RNA的囊泡疫苗在诱导抗肝癌免疫效应中的作用,为肝癌免疫治疗提供新的策略。方法:提取鼠源Hepa1-6肝癌细胞的基因组DNA和总RNA,进行WES全外显子组测序和RNA-seq转录组测序,以小鼠基因组GRCm39为参照,使用突变检测工具对测序结果进行非同义突变鉴定。NetMHCpan-4.1抗原表位预测工具分析新抗原表位肽与小鼠MHC-I(H-2Kb)的结合力,筛选最优候选新抗原。分别构建新抗原串联minigene重组质粒及小鼠IL-12重组质粒,通过体外转录合成新抗原mRNA(Neo-mRNA)及IL-12　m　RNA。采用差速离心法提取Hepa1-6细胞外囊泡(Extracellular　vesicles,EVs)作为核酸递送载体,利用电穿孔法将Neo-mRNA和IL-12　mRNA转导入EVs中,制备成EVs疫苗。分离小鼠骨髓细胞,IL-4及GM-CSF诱导成BMDC,负载EVs,同小鼠脾T细胞共培养,体外诱导CTL。流式细胞术检测CTL活化指标及共刺激分子表达。通过RTCA检测CTL对Hepa1-6细胞的体外杀伤作用。小鼠皮下注射Hepa1-6细胞构建移植瘤模型,腋窝淋巴结附近皮下注射EVs疫苗,每三天测量皮下肿瘤大小,疫苗治疗6周后,小鼠安乐死,剥离瘤块,用免疫组化检测CD3+T细胞浸润情况。结果:测序以及生信分析显示Hepa1-6细胞检测到522个突变抗原,其中181个呈高表达,抗原表位预测显示其中37个新抗原表位肽与MHC-I(H-2Kb)具有强结合力,最终筛选排名前20的强结合新抗原用于mRNA疫苗构建。电穿孔法成功将Neo-mRNA和IL-12mRNA导入EVs中,包封效率为(20.40±2.91)%。与对照组相比,EVs疫苗显著促进BMDC成熟,CTL活化标志物CD69及共刺激分子CD28、4-1BB表达水平显著上调,并且与Hepa1-6细胞共培养过程中IFN-γ和TNF-α分泌量显著增加。RTCA结果显示各组初始细胞指数(Cell　Index,CI)趋势一致,加入效应细胞后,EVs疫苗诱导的CTL表现出最强细胞毒性,36h后使靶细胞CI值降至对照组的50%,显著抑制肿瘤细胞增殖。成功构建小鼠皮下移植瘤,EVs疫苗治疗后,显著抑制肿瘤生长,免疫组化结果显示疫苗显著增强CD3+T细胞的浸润。结论;IL-12联合Hepa1-6新抗原m　RNA的囊泡疫...