A　novel　aptamer-based　label-free　electrochemical　impedance　spectroscopy　biosensor　for　17β-estradiol　has　been　fabricated.　The　aptamers　were　firstly　immobilized　on　the　gold　electrode　through　Au-S　interaction;　the　aptamer　probe　was　then　bound　with　the　addition　of　17β-estradiol　to　form　the　estradiol/aptamer　complex　on　the　electrode　surface.　This　leads　to　a　significantly　larger　interfacial　electron　transfer　resistance　than　that　without　the　addition　of　17β-estradiol.　The　change　in　the　resistance　had　a　linear　relationship　with　17β-estradiol　concentration　in　the　range　of　1.0　×　10　-8　to　1.0　×　10　-11　mol　L　-1,　with　a　detection　limit　of　2.0　×　10　-12　mol　L　-1.　The　biosensor　showed　high　selectivity　to　17β-estradiol　and　good　stability.　The　designed　biosensor　has　been　applied　to　detect　17β-estradiol　in　human　urine　with　satisfactory　results.　©　The　Royal　Society　of　Chemistry　2012.